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質(zhì)粒提取的原理與常見問題
點擊次數(shù):454 更新時間:2022-03-25

 

現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法,前兩種方法較為劇烈,適用于較小的質(zhì)粒(<15Kb),而去污劑裂解法則比較溫合,一般用于分子量較大的質(zhì)粒(>15Kb)。

 

堿裂解法是一種廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為:染色體DNA遠遠大于質(zhì)粒DNA,染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒為共價閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中,線性的大分子的染色體DNA*變性,而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可以恢復(fù)其天然構(gòu)象,在高鹽濃度存在的條件下,染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài),通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì),質(zhì)粒DNA仍在上清中。

 

質(zhì)粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位,包括真核生物的細胞器(主要指線粒體和葉綠體)中和細菌細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸分子?,F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細菌(大腸桿菌)、酵母菌和放線菌等生物中細胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因,例如,四環(huán)素抗性基因或卡那/霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome),這類質(zhì)粒能夠整合進細菌的染色體,也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細胞體內(nèi)外都可復(fù)制。(Vector)(DNA)

 

目前,已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細菌有幾百種,已知的絕大多數(shù)的細菌質(zhì)粒都是共價閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小,約為細菌染色體的0.5%~3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小,大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類:較大一類的相對分子質(zhì)量是40×106以上,較小一類的相對分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個細胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì),可以把質(zhì)粒分為兩類:一類是嚴緊型質(zhì)粒,當(dāng)細胞染色體復(fù)制一次時,質(zhì)粒也復(fù)制一次,每個細胞內(nèi)只有1~2個質(zhì)粒;另一類是松弛型質(zhì)粒,當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制,每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細胞的松弛控制之下的,每個細胞中含有10-200份拷貝,如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。

 

質(zhì)粒提取原理

現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法,前兩種方法較為劇烈,適用于較小的質(zhì)粒(<15Kb),而去污劑裂解法則比較溫合,一般用于分子量較大的質(zhì)粒(>15Kb)。

堿裂解法是一種廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為:染色體DNA遠遠大于質(zhì)粒DNA,染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒為共價閉合環(huán)狀分子。當(dāng)pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中,線性的大分子的染色體DNA*變性,而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可以恢復(fù)其天然構(gòu)象,在高鹽濃度存在的條件下,染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài),通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì),質(zhì)粒DNA仍在上清中。

 

質(zhì)粒提取常見問題分析

1、影響質(zhì)粒提取的因素有哪些?

質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān),如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細菌細胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。

 

2、為什么從革蘭氏陽性菌中提取質(zhì)粒要在懸浮液中加入溶/菌酶?

革蘭氏陽性菌有一層細胞壁,必須加入溶/菌酶才能使之溶解。

 

3、如何根據(jù)實驗需要選擇不同級別的產(chǎn)品?

從純度上:各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉(zhuǎn)化,普通純度的質(zhì)??梢詽M足要求;而對于轉(zhuǎn)染實驗,則要求使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒方能滿足要求。

從提取的量上:1-20μg,應(yīng)選擇小量提取試劑盒;20-40μg,應(yīng)選擇中量提取試劑盒;大于40μg,應(yīng)選擇大量提取試劑盒。

從宿主菌上:分為普通細菌質(zhì)粒提取試劑盒、G+菌質(zhì)粒提取試劑盒和酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒,根據(jù)情況進行選擇。

 

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