雙縮脲法(Biuret法)和Folin―酚試劑法(Lowry法)的明顯缺點(diǎn)和許多限制,促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法(Bradford法),是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn),因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。
考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為,染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精/氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。
Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:
(1)靈敏度高,據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍,其最/低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性最好。因而*不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。
(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點(diǎn)是:
(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨/酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差,在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g―球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性,因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。