做過(guò)HPLC的朋友都知道一句話：用流動(dòng)相溶解樣品（等度洗脫），或者是用初始流動(dòng)相比例溶解樣品（梯度洗脫）。為什么要這么做呢？

我們先來(lái)看一個(gè)列子：當(dāng)用100%的乙腈來(lái)溶解樣品上機(jī)時(shí)，峰1出現(xiàn)分叉、展寬，峰2未分叉。當(dāng)換成用流動(dòng)相來(lái)溶解樣品時(shí)，峰1和峰2的峰形都不分叉，峰形較好。是什么原因?qū)е逻@種現(xiàn)象發(fā)生的呢？那就是溶解效應(yīng)造成的。

溶劑效應(yīng)：就是指樣品溶液的溶劑強(qiáng)度強(qiáng)于流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度時(shí)可能會(huì)造成的峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。通常表現(xiàn)為色譜圖上較早洗脫的峰前沿或者開(kāi)叉，與此同時(shí)較晚洗脫的峰則較為正常的現(xiàn)象。例如樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強(qiáng)溶劑），而流動(dòng)相的組成則較弱，20%的乙腈與80%的水。第一個(gè)峰是開(kāi)叉的，并且與第二個(gè)峰相比，明顯地變寬了。當(dāng)樣品溶液的溶劑變成流動(dòng)相時(shí)，所有的峰形都改善了，且變得尖銳。

當(dāng)溶解樣品的溶劑不同于流動(dòng)相時(shí)，樣品溶劑與流動(dòng)相發(fā)生混合，樣品溶劑被大量的流動(dòng)相稀釋。如果樣品溶劑的強(qiáng)度高于流動(dòng)相，部分樣品在瞬間會(huì)表現(xiàn)為在較強(qiáng)溶劑中，并以較快速度通過(guò)色譜柱。表現(xiàn)在色譜圖上就是∶色譜峰的保留時(shí)間縮短。另一部分樣品被流動(dòng)相稀釋，在色譜柱上進(jìn)行充分的保留和洗脫過(guò)程，致使這些分子與溶解在強(qiáng)溶劑中的分子通過(guò)色譜柱的速度發(fā)生變化，使峰形扭曲，發(fā)生變形。洗脫較早的色譜峰峰變形要比洗脫晚的色譜峰嚴(yán)重。

那么如何判斷分叉的峰是否由溶劑效應(yīng)造成的呢？

第一種方法就是通過(guò)HPLC儀器比對(duì)一下兩個(gè)劈叉峰的紫外吸收波譜，看看他們是否能*一樣的UV特征吸收；第二種方法就是將進(jìn)樣體積調(diào)?。?.2μL），觀察峰是否好轉(zhuǎn)。如果滿足以上兩個(gè)條件，基本可以肯定是溶劑效應(yīng)造成的。

產(chǎn)生原因1，樣品溶液的溶劑很可能強(qiáng)于流動(dòng)相。例如樣品溶液的溶劑是100％乙腈（100％的強(qiáng)溶劑），而流動(dòng)相的組成則較弱，20％的乙腈與80％的水。

產(chǎn)生原因2，就是進(jìn)樣量比較大。

產(chǎn)生原因3，樣品的pH值與HPLC流動(dòng)相pH懸殊。比如酸性流動(dòng)相體系，樣品pH偏堿性（pH=9）,這種情況下也很有可能發(fā)生其實(shí)上面三個(gè)原因歸結(jié)起來(lái)就是一個(gè)原因，那就是樣品的溶劑與流動(dòng)相存在一些不一樣，當(dāng)樣品進(jìn)入流動(dòng)相的時(shí)候，由于這種巨大的差異，一部分樣品溶解進(jìn)入了流動(dòng)相，一部分還留在進(jìn)樣的溶劑里面，所以在HPLC上出現(xiàn)了保留的差異，所以要解決這個(gè)問(wèn)題的最佳方案就是，使用流動(dòng)相的起始梯度溶解樣品。

特別要說(shuō)明的一點(diǎn)，如果用強(qiáng)于流動(dòng)相的溶劑來(lái)溶解樣品，進(jìn)樣量較小時(shí)，也不一定會(huì)出現(xiàn)溶劑效應(yīng)現(xiàn)象。這是因?yàn)檫M(jìn)樣量較小，進(jìn)樣時(shí)樣品溶液瞬間被大量的流動(dòng)相所稀釋，被稀釋的樣品在柱子上有很好的保留和洗脫過(guò)程。

如果由于溶解度的問(wèn)題，不得不改用其余的溶劑，那就只能降低進(jìn)樣體積來(lái)解決，比如 5μl，1μL。