載體構(gòu)建是分子生物學(xué)研究常用的手段之一。通俗地可以描述為將一段目標(biāo)片段（基因CDS或者用于轉(zhuǎn)錄的sgRNA）插入環(huán)形DNA里面，并在體內(nèi)（一般大腸桿菌）高保真復(fù)制擴(kuò)增后用于后續(xù)科研實(shí)驗(yàn)。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，通常分為四種類型：
擴(kuò)增目的基因——構(gòu)建克隆載體；
表達(dá)目的基因——構(gòu)建表達(dá)載體；
編輯基因——構(gòu)建基因編輯載體；
轉(zhuǎn)染細(xì)胞——構(gòu)建病毒包裝載體。
載體的基本構(gòu)造
復(fù)制起始點(diǎn)：質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制起點(diǎn)，使質(zhì)粒得以在大腸桿菌中復(fù)制，這意味著你插入到質(zhì)粒中的目標(biāo)基因可以享受大腸桿菌的高保真復(fù)制系統(tǒng)。
抗性基因：帶有這個(gè)質(zhì)粒的大腸桿菌可以在有氨芐霉素抗性的LB平板上生長(zhǎng)，形成單克隆，而不帶有這個(gè)質(zhì)粒的菌株會(huì)中毒身亡?？梢院?jiǎn)單的認(rèn)為，在抗性平板上長(zhǎng)出的菌落代表質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。
標(biāo)簽蛋白：以lacZa及其附屬元件lac promoter為例，是表達(dá)beta半乳糖苷酶的元件，
lacZ可以將無(wú)色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)，菌落成藍(lán)色，lacZ基因中有供目的基因插入的多克隆位點(diǎn)（MSC），如果目基因成功插入，lacZ基因被破壞，無(wú)法表達(dá)半乳糖苷酶，菌落不能生成藍(lán)色物質(zhì)，故成白色?？梢院?jiǎn)單的認(rèn)為，白色菌落代表目標(biāo)基因成功插入。
多克隆位點(diǎn)：即酶切位點(diǎn)，是質(zhì)粒上的限制性酶切位點(diǎn)，可供目的基因插入的位點(diǎn)。
熒光標(biāo)記:含熒光蛋白的標(biāo)簽如GFP、RFP等，多見于表達(dá)載體。
接下來(lái)，我們以最/簡(jiǎn)單的克隆載體為例，學(xué)習(xí)下載體構(gòu)建的具體流程吧！對(duì)于構(gòu)建克隆載體，人們通常采取了多種策略進(jìn)行克隆，常用的有酶切酶連方法和同源重組方法，這兩個(gè)方法主要區(qū)別有三個(gè)方面：第一，靶基因片段擴(kuò)增引物有別于常規(guī)引物設(shè)計(jì)；第二，載體切割過(guò)程中進(jìn)行單酶切和雙酶切；第三，載體和目的基因片段的連接是基于同源重組或粘性末端互補(bǔ)。
構(gòu)建克隆載體的流程
1.載體選擇：
根據(jù)所要構(gòu)建的質(zhì)粒目的的差異以及載體和目標(biāo)片段的酶切位點(diǎn)分析結(jié)果來(lái)選擇載體。
2.引物設(shè)計(jì)：
酶切酶連方法的引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)特異性的目的片段擴(kuò)增引物，引物的長(zhǎng)度一般為18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之間GC含量不能相差太大，引物中需要加入兩個(gè)合適的酶切位點(diǎn)（需要擴(kuò)增的目的片段上無(wú)選擇的酶切位點(diǎn)）及保護(hù)性堿基。引物設(shè)計(jì)不當(dāng)可能在擴(kuò)增時(shí)生成引物二聚體，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不便。
同源重組方法的引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)引物時(shí)上游引物5’端前面加的是酶切位點(diǎn)及該酶切位點(diǎn)在載體中對(duì)應(yīng)前面的15個(gè)堿基載體片段，下游引物5’端前面加的是相同的酶切位點(diǎn)及該酶切位點(diǎn)在載體中對(duì)應(yīng)后面的15個(gè)堿基載體片段，如此設(shè)計(jì)引物是為了保證目的片段插入載體時(shí)方向正確，將目標(biāo)片段擴(kuò)增出來(lái)后以便與載體連接。
3.PCR擴(kuò)增：
以研究對(duì)象的DNA/cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，在引物兩端分別引入合適的酶切位點(diǎn)，使用1%瓊脂糖凝膠（根據(jù)片段大小選擇不同濃度的瓊脂糖凝膠）電泳檢測(cè)和回收回收目的基因DNA條帶。
4.載體和目標(biāo)片段的限制性酶切：
質(zhì)粒載體和目的基因PCR產(chǎn)物的進(jìn)行雙酶切；使用瓊脂糖凝膠（根據(jù)片段大小選擇不同濃度的瓊脂糖凝膠）電泳檢測(cè)和回收1%瓊脂糖凝膠電泳分別回收載體片段部分質(zhì)粒載體酶切大片段和目的基因酶切片段。
5.連接轉(zhuǎn)化：
使用DNA連接酶進(jìn)行載體片段部分和目的基因酶切片段質(zhì)粒酶切回收大片段與目的基因連接的連接，連接反應(yīng)在16℃反應(yīng)12 h小時(shí)。取10 L連接產(chǎn)物與100 L DH5α感受態(tài)細(xì)胞細(xì)菌混勻后冰浴30 min，42℃熱激90 s，立即置冰上放置5 min，加入預(yù)熱至室溫的700 L LB培養(yǎng)基， 37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)50 min，吸取 200 L的菌液，用移液器混勻后均勻涂布于含100 g/mL Ampicillin抗性的LB平板上（根據(jù)載體上的抗性篩選標(biāo)記選擇合適的抗性平板，以 Ampicillin抗性為例）， 37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
6.挑取克隆提質(zhì)粒驗(yàn)證：
（1）菌落PCR驗(yàn)證：挑取5-10個(gè)單菌落直接進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
（2）酶切驗(yàn)證：PCR驗(yàn)證陽(yáng)性的菌落接種于含5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中，300 rpm，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜。收集菌體，使用，對(duì)過(guò)夜的菌液進(jìn)行擴(kuò)增，選擇陽(yáng)性菌液，用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。（也可以不進(jìn)行酶切驗(yàn)證，直接進(jìn)測(cè)序驗(yàn)證。）
（3）測(cè)序驗(yàn)證。
其他類型的載體構(gòu)建后面會(huì)陸續(xù)分享，請(qǐng)小伙伴們持續(xù)關(guān)注。
