菌株保存要求

菌種作為一項重要的生物資源，對微生物學教學和研究是bi不可少的。菌種保存方法因微生物的不同而異。在菌種保存過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，故菌種保存方法多依據這三個因素而設計。

菌種保存方法有多種，最li想的為真空冷凍干燥法，具有保存時間長、成活率高、變異小等優(yōu)點，但操作技術難度大，花費高，需特殊設備，一般單位不易做到，而一些常規(guī)方法，常因傳代次數多、易污染、易變異，給保存帶來諸多不利。

多年來，微生物學工作者們一直在研究摸索簡便而行之有效的菌種保存方法，遠慕生物總結了幾種方法簡便、效果好的保存方法，現介紹如下。

需要4℃冰箱保存的保存法

1、液體石蠟保存法

先將液體石蠟滅菌，然后放于37℃恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。再將需要保存的菌種在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長好的斜面培養(yǎng)基上，用量以高出斜面頂端1cm 為準。試管需直立，置4℃或室溫下保存，一般無芽胞細菌可保存1年左右。

2、高層半固體瓊脂石蠟保存法

將需保存的菌種經平板劃線分離后，挑單個菌落用接種針反復穿刺接種到高層半固體瓊脂培養(yǎng)基中，經37℃12小時培養(yǎng)后取出，用無菌操作將滅菌的液體石蠟滴加半固體瓊脂菌種管表層約0.5cm高度，存放4℃冰箱，1年轉種1次。

3、蒸餾水保存法

取滅菌蒸餾水6-7ml加于試管斜面上，用吸管研磨，洗下菌苔充分混勻，將此菌液分裝于滅菌的螺旋小瓶中，或用膠塞密封，置4℃保存可存活數年。

需-20℃冰箱冷凍保存的保存法

1、甘油保存法

甘油一生理鹽水保存液的制備：取甘油(分析純)8份加入生理鹽水2份，充分混合后，經121.3℃ 30分鐘滅菌備用。

將純化后的菌株根據菌種不同分別劃線接種于其最適宜生長的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，用接種針取典型菌落接種肉湯管37℃培養(yǎng)6-8小時(鏈球菌和奈瑟氏菌接種血清肉湯管，5-10%CO2環(huán)境下8-10小時培養(yǎng)，真菌直接用接種環(huán)取菌洗入肉湯管，不培養(yǎng))。此為培養(yǎng)液。

將此培養(yǎng)液與保存液以5：2的比例混合分裝于滅菌的微量離心管，置-20℃冰箱保存(鏈球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用時需37℃水浴中快速解凍。

用上述方法保存一般菌株可存活3年以上，鏈球菌、奈瑟菌可存活12-15個月，且性狀未發(fā)生變異。此方法采用幼齡肉湯培養(yǎng)物效果好，且適用于鏈球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種。

2、低溫保存法

菌種保存液的配制：K2HPO412.6g，檸檬酸鈉0.98g，MgSO4·7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g加蒸餾水至1000ml，103.4KPa滅菌30分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩?br/>
將細菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)16-18小時，或斜面培養(yǎng)物刮取于生理鹽水中，然后加入等體積的菌種保存液，凍存于-70℃或-20℃冰箱中。

此方法也適合甲鏈、肺球、流感桿菌、百日咳桿菌、綠膿桿菌等耐受力低的細菌。-70℃保存10年以上，-20℃可保存2年以上。

3、細菌濕種牛奶凍存法

新鮮牛奶或15%奶粉煮沸，冷卻脫脂，分裝小試管，每管1ml，8磅15分鐘滅菌備用。

將純種菌接種于平板，37℃16小時培養(yǎng)，以接種環(huán)刮取菌苔2-3環(huán)于牛奶中混勻，試管用硅膠塞，凍存于普通冰箱冷凍室(-12℃-18℃)。使用時取出室溫溶解，待部分溶解時即可取一環(huán)接種平板，并將試管再迅速凍存，這樣可反復使用3-5次。此法一般菌株可存活48個月，少數如奈瑟氏菌、甲鏈、白喉等可存活14-30個月。

4、甘油原液保存法

將各待保存的菌種純化后用接種環(huán)直接從平板上刮取，置于盛有0.5ml甘油原液的菌種瓶中，-20℃保存，可連續(xù)52個月存活良好。

此法尤其適合乙鏈、破傷風桿菌、產氣莢膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌種，是一種簡便實用的有效保存方法。

需低溫-30或-70℃冰箱保存

1、脫纖維羊血

無菌抽取羊頸靜脈血后，沿瓶壁注入無菌的帶玻璃的三角燒瓶中，同時立即同一方向振搖約8-10分鐘，脫去纖維，然后分裝加蓋無菌小試管中約1.0-1.5ml。

將腦膜炎雙球菌、淋球菌、甲乙型鏈球菌、肺炎雙球菌分別接種于血平板培養(yǎng)基中，前兩者置于5-10% CO2 燭缸內，經35℃16-18小時培養(yǎng)，后三者置37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時，然后無菌操作取一接種環(huán)菌苔移種于上述新鮮脫纖維羊血試管中，立即置-3O℃冰凍保存二年轉種一次。用時室溫自然冰融即可接種。

2、 紙片法

新華定性濾紙剪成4mm×4mm，1.5ml帶蓋離心管消毒滅菌備用，用消毒小鉗子鉗上濾紙片于平板上刮取待保種的純菌落2-3個。放于離心管內塞蓋再用封口膠布將蓋邊緣封好放于-30℃冰箱保存。保存12個月后取出菌種解凍后用無菌鉗取一片放于肉湯管內37℃培養(yǎng)12小時后轉種血平板，性狀未變異。

3、 奶粉液菌種保存法

菌種保存液：脫脂奶粉10g，NaCL 10.5g，加雙蒸水100ml，121℃ 5分鐘高壓滅菌后分裝于1ml帶蓋無菌標本杯中(0.5ml)備用。

無菌操作用4mm×10mm 無菌濾紙條蘸取新鮮菌少許，放存含奶粉液保存杯中，蓋好，封口膠封口，低溫保存。3年存活率達99.2% 。

使用時將標本杯取出，不等全部融化，上層有少許融化即用接種環(huán)取一少許接種于血平板分離即可。

結論

菌種是細菌工作中所bu可缺少而又具有傳染性生物學因子。為了保證工作和安全，對菌種必須妥善保存和保管。保存菌種不僅要求不死，還要求其生物學性狀、生理特性、抗原性等方面不發(fā)生變異，這是保存菌種的重要環(huán)節(jié)。延長菌種存活期應注意：首先，待保存菌種須選擇生長期幼齡培養(yǎng)物，且制成濃菌液保存，以保證存活率。其次，高層半固體培基最好選擇不含或含糖量低的培基，可減少或避免因代謝產物產生而造成的細菌死亡。最后，保存溫度的高低可影響存活率，切忌反復凍融。